对高分辨率表征生物分子特性的实验方法的追求持续推动着分析技术发展的创新。分子的尺寸和形状是区分溶液中分子种类和状态的关键立体测量因素。

鉴于此，牛津大学Madhavi Krishnan教授描述了一种基于微芯片的高通量成像方法，可在天然溶液条件下快速精确地测定分子特性。该方法可以检测小分子中至少三个数量级、甚至两个碳原子的分子量差异。作者量化了亲和常数六个数量级以上的分子相互作用强度，并实时跟踪反应。对单个分子进行高度并行的测量，可以以最高分辨率表征样品状态的异质性，从而为三维结构建模提供预测性输入。他们进一步利用该方法的结构灵敏度进行诊断，利用配体诱导的胰岛素受体构象变化来感知亚纳升和亚泽普托摩尔级的胰岛素浓度。相关研究成果以题为“Measurements of molecular size and shape on a chip”发表在最新一期《science》上，论文第一作者为Zhu Xin和Timothy J. D. Bennett。

【平移熵的空间调整可实现高通量测量和分子计数】

逃逸时间立体测量法（ETs）把荧光分子囚禁在高度 h₁≈20–70 nm的硅/玻璃狭缝中，狭缝壁上按周期刻蚀出宽 550 nm、深 ≈ 250 nm 的“熵阱”。当分子跳入阱内时会损失平动熵；尺寸越大（或表现出更大有效横截面的）分子损失越多，因此停留时间越长。平均逃逸时间tₑₛ꜀ ∝ rᴴ exp(W/kᴮT)，直接关联到水动力半径 rᴴ和包围球直径 Dₛ，从而可由每秒 100 帧、≈ 5 W mm⁻² 激发的电影推断结构信息。典型轨迹显示：碳酸酐酶（29 kDa）Δt ≈ 10 ms，胰岛素六聚体（≈ 34 kDa）17 ms，IgG (150 kDa) 36 ms，佐证质量依赖性。

图1.溶液中逃逸时间立体测量法（ET）的原理和概述

【对分子量的敏感性】

在 0.5–500 kDa 的三阶数量级范围内，ETs 符合预期标度：致密蛋白 tₑₛ꜀ ∝ M¹ᐟ³，无序链 ∝ M³ᐟ⁵。对 tₑₛ꜀的统计精度优于 1 %，对应质量误差< 3 %。方法能分辨 ATTO-532 衍生物间的25 Da 差异；对 1 kDa 分子，理论上能解析≈10 Da，因为常规可取得 ≈0.5 % 的 tₑₛ꜀精度。以 NHS-酯水解（ΔM = 97 Da）为例，平均逃逸时间在 pH 9 下半衰期 4.9 min 内下降 3 %，验证了动力学能力。对 56–60 bp双链 DNA，狭缝高度收窄至 ≈ 25 nm 时，单碱基对增量即可分辨，突显亚纳米质量分辨率。

图2.测量的逃逸时间对分子量的敏感性

【对三维形状的敏感性】

旋转的非球形分子采样到大于同 rᴴ球体的 Dₛ，故 ETs 对形状极其敏感。当 h₁接近分子长度时，杆状分子的逃逸时间与球体预测呈非线性偏离。30–60 bp 双链的 ETs 数据拟合得 B-DNA 轴向步长 3.17 ± 0.07 Å bp⁻¹，A-RNA 2.27 ± 0.06 Å bp⁻¹，与晶体学吻合。两种 240 nt DNA 纳米结构（“方形瓦片”与六螺旋“束”）rᴴ相同，却在h₁ = 40 nm时tₑₛ꜀相差 20–25 %。在 41 nm 与 74 nm 两高度测得 tₑₛ꜀，联立求得束体rᴴ ≈ 4.7 nm、Dₛ ≈ 5.0 nm；瓦片rᴴ ≈ 4.4 nm、Dₛ ≈ 4.4 nm，与 oxDNA-SAXS 模型相符。

图3..逃逸时间读数对分子形状（3D构象）的灵敏度

【SAM-IV核糖开关的单分子构象谱】

10 pM RNA 下，每分子记录 200–300 次跃迁（≈ 7 s）可构建“逃逸时间谱”，以每个分子的平均tʰᵒᵖ为柱。119 nt SAM-IV 适配体呈三峰：μ₁≈ 12 ms（自由染料），μ₂≈ 16 ms（~60 %），μ₃≈22 ms（~34 %）。μ₃吻合 cryo-EM 结构（PDB 6UES）模拟的椭球(Dₛ ≈ 9 nm, rᴴ ≈ 3 nm)；μ₂对应更致密状态，Dₛ与rᴴ均减≈10 %。加入饱和 SAM 后时间不变，说明配体结合不改全局折叠，与结构先例一致。

图4.SAM-IV核糖开关构象的单分子光谱及其与结构模型的比较

【DNA 杂交动力学与热力学】

10-mer ATTO-532 寡核苷酸自由t₁≈10 ms，与互补 200-nt 骨架结合后移至t₂≈35 ms。一分钟直方图双指数拟合得结合分数 m₂随骨架浓度变化；当寡核苷酸长度由 15 降至 7 nt 时，得到 Kᴅ 10⁻¹¹–10⁻⁴ M。单芯片即可在混合后实时跟踪结合（keq）和“追赶”后解离（koff），从而在几分钟内求得 kon 并独立验证 Kᴅ，动态范围跨六个数量级。

图5..测量DNA杂交中的结合和解离速率以及结合亲和力

【DNA-蛋白与蛋白-蛋白相互作用】

结合若引起显著tₑₛ꜀变化，可用多组分拟合。EcoRI 与 24-bp 双链结合使tₑₛ꜀增三倍，得 Kᴅ = 1.5 ± 0.4 nM，与文献一致。若变化<10 %，改用平均逃逸时间⟨t⟩。HLA-A*03:01 抗原(48 kDa)与单克隆抗体 W6/32 结合，⟨t⟩升 40 %，求得 Kᴅ = 0.43 ± 0.19 nM，检测下限<100 pM 抗体。31-mer G-四链体胰岛素适配体在 Mg²⁺中折叠（⟨t⟩降 10 %），并以 Kᴅ ≈ 87 ± 18 nM 结合胰岛素；适配体-胰岛素复合物质量增加致⟨t⟩升 15 %。若改用荧光胰岛素作“诱饵”，结合后tₑₛ꜀变慢，可读出胰岛素受体外部结构域(IR-ECD) Kᴅ ≈ 7.2 ± 1.2 nM。

图6.测量DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用中的结合亲和力

【胰岛素受体外部结构域构象读出】

标记的 IR-ECD 在 40 nm 狭缝中 ⟨t⟩ = 22.5 ± 0.3 ms；加入 100 nM 胰岛素后缩短至 21.0 ± 0.1 ms，即受体虽增 25 kDa 却运动更快。将h₁自 60 调至 30 nm 测tₑₛ꜀，将非配体与配体状态映射到不同(Dₛ, rᴴ)带；交点显示 apo 受体比紧凑“ T-态”宽≈1.5 nm，rᴴ大 0.25 nm。在缓冲液中滴定得Kᴅ ≈ 2–12 nM；模拟血清 2–4 nM；人血清中显见 Kᴅ ≈ 0.1 nM，证明ETs 耐受生物基质，可检测≈1 nM 游离胰岛素，接近生理上限。

图7.胰岛素受体胞外域（IR-ECD）与胰岛素结合后的构象变化检测和结构建模

【总结】

ETs 在单一、无锚定、低功率溶液实验中统一了结构、热力学与动力学测量：(i) 对 500 Da–>500 kDa 对象推断rᴴ与Dₛ，质量误差<3 %；(ii) 分辨形状异构体、构象体与寡聚状态；(iii) 测定 10⁻¹⁵–10⁻³ M 亲和力并在数分钟内解析 kon/koff；(iv) 检测下限 10 fM 荧光分析物，适用于复杂样品；(v) 利用配体诱导的构象变化作为放大诊断信号。熵阱景观由光刻定义，可进一步工程化其动态范围、通量与灵敏度。作者认为ETs 对传统合束方法难以捕捉的弱、瞬态或多聚体组装尤为有力，也适合机器学习预测结构的高通量验证。

来源：高分子科学前沿

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